DELEN | AFDRUKKEN | E-MAIL
Ik wil beginnen met een herinnering die vaak verloren gaat in openbare discussies: De Covid-mRNA-vaccins zijn werkelijk nieuwe medische producten.
Vóór de noodgoedkeuringen in 2020 was mRNA-vaccintechnologie nog nooit op grote schaal bij mensen toegepast. Slechts twee klinische studies, één van Pfizer-BioNTech en één van Moderna, hadden dit platform ooit bij mensen getest. In totaal hadden ongeveer 37,000 mensen in de geschiedenis van de geneeskunde een mRNA-vaccin ontvangen (exclusief de eerdere ervaringen met vaccins tegen hondsdolheid, CMV en kanker, die beperkt bleven tot veel kleinere studies in een vroege fase). Dit is geen kritiek; het is simpelweg een constatering. Maar het betekent wel dat het veiligheidsprofiel van deze producten op de lange termijn onvolledig bekend was en nog steeds is.
Wat volgt is bekend bij vrijwel alle moleculair biologen. Het is ingewikkeld, maar ik probeer het te vereenvoudigen gezien het belang ervan. Het is belangrijk om het moleculaire raamwerk voor iedereen duidelijk uiteen te zetten, omdat de manier waarop deze vaccins worden gemaakt direct bepaalt wat er in het flesje zit.. En wat zich in het flesje bevindt, zal na injectie door het hele lichaam reizen en een reeks gebeurtenissen in gang zetten die tot gezondheidsproblemen op lange termijn kunnen leiden.
In vitro transcriptie is niet zomaar een productiedetail.
Gemodificeerde mRNA-vaccins worden geproduceerd met behulp van een proces dat in vitro transcriptie (IVT) wordt genoemd.)IVT is de methode die gebruikt wordt om het gemodificeerde mRNA te synthetiseren dat uiteindelijk het actieve bestanddeel van het vaccin wordt.
Dit is geen onbelangrijke technische kwestie. IVT bepaalt fundamenteel de moleculaire samenstelling van het eindproduct.
Wetenschappers van BioNTech, waaronder degenen die direct betrokken waren bij de ontwikkeling van het Pfizer-vaccin, hebben een gedetailleerd overzicht gepubliceerd.1 Hierin wordt beschreven hoe IVT-reacties niet alleen het beoogde mRNA van volledige lengte genereren, maar ook een reeks bijproducten en onzuiverheden, hoe deze doorgaans worden verwijderd en wat de biologische gevolgen kunnen zijn als ze blijven bestaan. Deze productie-instructies, samen met de bijproducten die ze creëren, werden ook gedetailleerd beschreven door Moderna in hun patenten (US10,653,712 B2 en US10,077,439 B2). Maar belangrijker nog, deze moleculaire biologie was al lang vóór Covid goed ingeburgerd. Niets hiervan is speculatief.
Het uitgangsmateriaal: DNA-templates
In de kern begint een IVT-reactie met dubbelstrengs DNA dat codeert voor het gewenste eiwit. In dit geval het spike-eiwit van SARS-CoV-2.
De spike-coderende sequentie die in mRNA-vaccins wordt gebruikt, is genetisch gemodificeerde Om de stabiliteit en cellulaire tolerantie te verbeteren, zijn er twee aminozuursubstituties aangebracht waardoor het zich onderscheidt van de virale spike. Die modificatie is opzettelijk.
Het DNA-sjabloon zelf kan verschillende vormen aannemen. Tijdens de eerste klinische onderzoeken van Pfizer werden via PCR gegenereerde DNA-fragmenten gebruikt. Het commerciële productieproces was echter gebaseerd op DNA afkomstig van plasmiden. Dit is belangrijk omdat plasmiden aanvullende regulerende sequenties bevatten. In het geval van Pfizer gaat het om elementen zoals de SV40-promotor en ori-sequenties, die zorgen baren als ze menselijke cellen zouden binnendringen.
Zodra deze DNA-template, samen met RNA-polymerase en andere componenten, aan de IVT-reactie wordt toegevoegd, wordt deze getranscribeerd naar mRNA (Figuur 1).
IVT produceert bijproducten door ontwerp
Hoewel de gewenste output van IVT het beoogde mRNA-product van volledige lengte is, is de daadwerkelijke output complexer. Deze omvat verschillende bijproducten in de vorm van (1) verschillende RNA-soorten, waaronder dubbelstrengs RNA (dsRNA), (2) DNA gehecht aan RNA (RNA-DNA-hybriden), en (3) het vrije DNA van de oorspronkelijke template (Figuur 2).
De vorming van deze bijproducten is goed gedocumenteerd en onvermijdelijk, en daarom is zuivering na de productie absoluut essentieel voor de veiligheid.
Figuur 2. Bijproducten en verontreinigingen van de IVT-productie. Afbeelding aangepast van 1.
Zuivering kent bekende beperkingen.
Na de productie zijn er twee zuiveringsstappen nodig om eerst het DNA te verwijderen en vervolgens de RNA-bijproducten (Figuur 3):
Figuur 3. Verwijdering van bijproducten bij IVT. Afbeelding aangepast van 2.
Om het DNA te verwijderen, wordt een enzym genaamd DNase I aan het reactiemengsel toegevoegd. Dit enzym wordt vaak gebruikt om verontreinigend DNA af te breken. Hoewel DNase I effectief is tegen vrij template-DNA, tonen meerdere studies, waaronder onderzoek van wetenschappers van BioNTech zelf, aan dat DNase I niet efficiënt is in het verwijderen van DNA dat aan RNA is gebonden (RNA-DNA-hybriden).
Deze beperking is niet omstreden. Ze is gedocumenteerd in de literatuur.
Wat onafhankelijke analyses hebben aangetoond
Deze context is cruciaal voor de interpretatie van recente onafhankelijke analyses van voltooide vaccinflacons.
Onderzoekers3 en toezichthouders4 hebben melding gemaakt van de aanwezigheid van DNA-verontreinigingen in vrijwel elk getest flesje. Deze verontreinigingen omvatten zowel dubbelstrengs DNA als RNA-DNA-hybriden die resistent bleken tegen DNase I-vertering.
In sommige monsters was het DNA dat codeert voor een spike-eiwit in hoeveelheden aanwezig die meer dan 100 keer hoger waren dan die van andere plasmidesequenties.5Dit suggereert een ongelijkmatige of onvolledige digestie. Sequentiebepaling en kwantitatieve PCR-analyses brachten verder DNA-fragmenten aan het licht met een gemiddelde lengte van ongeveer 200 basenparen, waarvan sommige meer dan 4 kilobasen lang waren. In verschillende gevallen werden sequenties waargenomen die bijna het gehele plasmide omvatten.
Al met al roepen deze bevindingen serieuze vragen op over de consistentie en volledigheid van de zuivering tijdens grootschalige productie, en over de mogelijke biologische gevolgen van achtergebleven nucleïnezuren bij mensen.
Waarom nucleïnezuurverontreinigingen biologisch van belang zijn
RNA en DNA zijn krachtige activatoren van aangeboren immuunreacties. Dit is geen speculatie. Patroonherkenningsreceptoren en het cGAS-STING-pad reageren krachtig op vreemde nucleïnezuren, wat ontstekingen, groeiremming en zelfs celdood teweegbrengt.
Precies om deze mechanismen zijn producten voor gentherapie onderworpen aan strenge veiligheidscontroles.
Ironisch genoeg werden de Covid-mRNA-vaccins juist zo ontworpen dat ze deze krachtige activering van het aangeboren immuunsysteem juist moesten verminderen. Maar RNA-DNA-hybriden en DNA-fragmenten zullen ondanks die aanpassingen nog steeds sterke immuunreacties oproepen.
Volharding roept nieuwe vragen op.
Er is nu aanzienlijk bewijs dat aantoont dat spike-mRNA en -eiwit weken, maanden en zelfs jaren na vaccinatie in menselijk weefsel aanwezig blijven (Tabel 1).
We weten nog niet of deze persistentie het gevolg is van langdurige mRNA-stabiliteit, voortdurende translatie of DNA-gebaseerde mechanismen. Maar gezien de plausibiliteit van DNA-integratie en de aanwezigheid van langlevend, niet-geïntegreerd plasmide-DNA in spiercellen,6 Het is niet onredelijk om aan te nemen dat de persistentie van Spike mRNA, eiwit en antilichamen tegen Spike jaren na vaccinatie verband houdt met de DNA-onzuiverheden en bijproducten na IVT.
Tabel 1. Persistentie van spike-mRNA en -eiwit na vaccinatie bij mensen.
Veiligheidsimplicaties op korte en lange termijn
Al deze gegevens samen geven aanleiding tot diverse belangrijke veiligheidsoverwegingen.
Ten eerste zijn er acute immuunreacties gemeld, waaronder cytokinestormen en anafylaxie, direct na vaccinatie. Zulke sterke ontstekingsreacties mogen niet zomaar worden afgedaan als niet gerelateerd aan onzuiverheden, zeker niet gezien wat bekend is over door nucleïnezuren geïnduceerde immuunactivering.
Ten tweede, en nog belangrijker, zijn er de risico's op lange termijn. Aanhoudende expressie van spikes zou mogelijk kunnen bijdragen aan chronische immuunsyndromen. Nog zorgwekkender is de mogelijkheid van DNA-integratie, wat risico's met zich meebrengt van insertiemutagenese of genverstoring. Dit betekent een risico op kanker of ontwikkelingsstoornissen, afhankelijk van waar en op welke leeftijd het DNA is geïntegreerd.
Opvallend is dat de FDA zelf in haar informatiebladen stelt dat deze vaccins niet zijn geëvalueerd op carcinogeniciteit (kankervorming) of genotoxiciteit (DNA-schade), een punt dat routinematig en te verwachten is bij toezicht op gentherapie, waar langdurige monitoring de standaard is.
De regelgevingskloof rond DNA in mRNA-vaccins
Aangezien er geen discussie meer is over de aanwezigheid van rest-DNA in mRNA-vaccins, is de vraag of de huidige richtlijnen en veiligheidslimieten wel geschikt zijn voor mRNA-vaccins. Ons is verzekerd dat de DNA-bijproducten binnen de in de regelgeving vastgestelde limieten vallen. Wat zijn dan de richtlijnen van de FDA met betrekking tot DNA-bijproducten en verontreinigingen?
De meest geciteerde FDA-richtlijn over rest-DNA (≤10 ng per dosis) is ontwikkeld voor virale vaccins die in levende cellen worden geproduceerd en die gefragmenteerd en "naakt" zijn, met een beperkt vermogen om menselijke cellen binnen te dringen. mRNA-vaccins worden echter niet in cellen geproduceerd, hun rest-DNA is niet afkomstig van de gastcel en, belangrijker nog, het DNA in mRNA-vaccins is niet naakt. Het is gekoppeld aan LNP-toedieningssystemen, die het specifiek zeer gemakkelijk maken voor het DNA om cellen binnen te dringen. De FDA-richtlijn uit 2010 stelt duidelijk dat er geen relevante veiligheidsdrempel is vastgesteld voor DNA dat is gekoppeld aan op LNP gebaseerde producten.
Een andere veel geciteerde richtlijn is afkomstig van de WHO voor recombinant-eiwittherapieën, die betrekking heeft op rest-DNA in producten zoals monoklonale antilichamen of hormonen die in genetisch gemodificeerde cellen worden geproduceerd. Ook hier is het rest-DNA afkomstig van gastheercellen of expressieplasmiden, is het aanwezig als een spoor van niet-ingekapseld DNA (naakt), en is het eindproduct een gezuiverd eiwit, geen op nucleïnezuur gebaseerde therapie (mRNA-vaccin). Deze richtlijn is dus niet van toepassing op mRNA-vaccins.
Noch de FDA, noch de WHO-regelgeving die het vaakst wordt aangehaald voor resterend DNA, Deze vaccins zijn ontwikkeld voor mRNA-vaccins en gaan niet direct in op dit veiligheidsprobleem.
Wat de WHO zei over mRNA-vaccins — na de introductie ervan
In 2022 publiceerde de Wereldgezondheidsorganisatie richtlijnen die specifiek betrekking hadden op mRNA-vaccins.7Opvallend is dat dit document werd vrijgegeven. na de wereldwijde uitrol van deze producten. Er staat specifiek vermeld dat deze richtlijn een reactie was op: “de veiligheids-, productie- en regelgevingskwesties die met deze nieuwe technologie samenhangen.Het document bevat tevens een aantal belangrijke uitspraken:
"Omdat er nog geen gedetailleerde informatie beschikbaar is over de gebruikte productiemethoden, de controles voor veilige en effectieve mRNA-vaccins nog niet gestandaardiseerd zijn en bepaalde details bedrijfseigen zijn en dus niet openbaar beschikbaar, is het op dit moment niet mogelijk om specifieke internationale richtlijnen of aanbevelingen te ontwikkelen."
Er staat verder: “De gedetailleerde productie- en controleprocedures…moeten worden besproken met en goedgekeurd door de NRA [Nationale Regelgevende Autoriteit].] op basis van een individuele, geval-voor-geval beoordeling."
De WHO erkent dat de controlemechanismen voor mRNA-vaccins nog niet gestandaardiseerd zijn en dat het niet haalbaar is om specifieke internationale richtlijnen of aanbevelingen op te stellen. Bovendien is toezicht door regelgevende instanties nodig voor een individuele beoordeling door de nationale autoriteiten.
Dit werd gezegd nadat de mRNA-vaccins al waren ingezet..
En op het moment van schrijven van deze Substack heeft de FDA nog steeds geen gestandaardiseerde richtlijnen voor mRNA-vaccins vastgesteld en geen bewijs of veiligheidsgegevens verstrekt die eventuele beperkingen van DNA in mRNA-vaccins onderbouwen.
Tot slot is het belangrijk om te benadrukken: hoewel mRNA-technologie niet nieuw is, werd deze vóór Covid gereguleerd als gentherapie, niet als een traditioneel vaccin. De veiligheidsproblemen rond de DNA-bijproducten in Covid-vaccins zullen dezelfde zijn als bij elk mRNA-vaccin, inclusief vaccins tegen griep, RSV of zelfs mRNA-vaccins tegen kanker.
Dit komt doordat mRNA-producten fundamenteel anders zijn. Ze moeten cellen binnendringen en deze instrueren om een vreemd eiwit te produceren. Dit is anders dan bij alle conventionele vaccins die het eiwit rechtstreeks toedienen. Er is geen klinisch precedent voor dit platform, en er is geen klinisch precedent voor herhaalde toediening. En al helemaal geen precedent op populatieniveau.
In dit stadium, zonder pandemie, met de toenemende hoeveelheid mechanistische gegevens en klinische observaties, en de wildgroei aan mRNA-vaccins die op de markt komen, hebben we transparantie en directe betrokkenheid van regelgevende instanties nodig, met name de FDA, die belangrijke richtlijnen moet opstellen voor de productie van deze producten – vooral met betrekking tot DNA-bijproducten.
Nieuwe technologieën vereisen een nieuwe vorm van onderzoek – geen stilzwijgen, manipulatie of censuur.
Referenties
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al. Mol Pharm. 2022 4 april;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – “Detectie van integratie van plasmide-DNA in gastheer-genomisch DNA na intramusculaire injectie en elektroporatie” (Gene Therapy, 2004). Bij muizen werd naakt plasmide-DNA intramusculair geïnjecteerd, gevolgd door elektroporatie om de opname te verbeteren. Met behulp van een zeer gevoelige PCR op gezuiverd genomisch DNA (met gelelektroforese om extrachromosomale vormen te verwijderen) identificeerden de auteurs vier onafhankelijke integratiegebeurtenissen 4 weken na injectie. Junction-sequencing bevestigde willekeurige integratieplaatsen (geen voorkeurshotspots), consistent met niet-homologe eindverbinding. De integratiefrequentie was laag, maar meetbaar. Dit is een van de duidelijkste demonstraties van daadwerkelijke spontane integratiegebeurtenissen in vivo voor naakt plasmide-DNA in spieren. Opmerkelijk is dat in deze studie gebruik werd gemaakt van verbeterde DNA-afgifte via elektroporatie, wat vergelijkbaar is met verbeterde afgifte via LNPs.
Martin et al. (1999) – “Plasmid DNA Malaria Vaccine: The Potential for Genomic Integration after Intramuscular Injection” (Human Gene Therapy). In deze eerdere studie werd plasmide-DNA intramusculair toegediend aan muizen. Southern blot-hybridisatie en PCR op hoogmoleculair genomisch DNA werden gebruikt om integratie te onderzoeken. Hoewel persistentie voornamelijk extrachromosomaal was, rapporteerden ze aanwijzingen voor zeldzame integratie in sommige monsters (hoewel niet zo definitief gesequenced als in latere studies). Het onderzoek zette een norm voor een laag risico, maar erkende de mogelijkheid van zeer zeldzame gebeurtenissen, wat van invloed was op latere richtlijnen van de FDA voor DNA-vaccins.
Ledwith et al. (2000) – “Plasmid-DNA-vaccins: Onderzoek naar integratie in gastheer-cellulair DNA na intramusculaire injectie bij muizen” (Intervirology). Naakt plasmid-DNA werd intramusculair geïnjecteerd bij muizen en hoewel er geen detecteerbare integratie werd waargenomen, werd er tot 26 weken nog steeds DNA gedetecteerd in de quadricepsspier. Het DNA was extrachromosomaal.
7 WHO Expert Committee on Biological Standardization 74e rapport, bijlage 3. Evaluatie van de kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid van mRNA-vaccins voor de preventie van infectieziekten: regelgevingsaspecten https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser is een vooraanstaand hoogleraar aan de afdeling Ontwikkelingsbiologie, Moleculaire Biologie en Chemische Biologie van de Tufts University School of Medicine en directeur van het Tufts Convergence Laboratory. Dr. Kuperwasser staat internationaal bekend om haar expertise op het gebied van borstklierbiologie, borstkanker en preventie. Ze is lid van de Adviescommissie Immunisatiepraktijken.
Bekijk alle berichten
